欧博娱乐CLIP实验技术介绍
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CLIP实验技术介绍
一、技术概述
CLIP（Cross-Linking and Immunoprecipitation）是一种结合紫外线交联与免疫沉淀的高分辨率技术，欧博娱乐用于精准研究RNA结合蛋白（RBP）与RNA的相互作用。
二、实验目的
本实验通过交联固定RBP与RNA的瞬时结合位点，结合高通量测序（如CLIP-Seq），可在单碱基水平解析RNA-蛋白互作网络，揭示其在转录后调控、疾病发生及细胞功能中的分子机制。
三、实验流程
1.磁珠准备：
1) 取30ul Protein A/G磁珠到1.5ml离心管；于磁力架上静置1min，去上清；并用500ul洗涤液洗涤3遍。
2) 用100ul 裂解液重悬磁珠，分别加入10ug目的抗体或IgG；4℃反转孵育2h;
3) 于磁力架上静置1min，去上清；用500ul洗涤液洗涤3遍。
2.样本处理：
1) 吸除培养基，并用 5 mL/板预冷的 1×PBS洗一次，吸掉PBS；
2) 将细胞放在冰上，置于365nm紫外灯下进行交联，交联时间 10 min；
3) 收集细胞到1.5ml的离心管子，去上清；
4) 用3倍体积的裂解液裂解细胞（使用前加入蛋白酶抑制剂及终浓度1 mM DTT），冰上放置10min；
5) 4℃ 10000×g离心15min，转移上清到新的1.5ml离心管中；
6) 加入RNase T1 stock 至终浓度1 U/μL；并于22℃孵育10min；
7) 用500ul细胞裂解液重悬抗体-磁珠混合物；并4℃翻转孵育3h；
8) 用1mL洗涤液洗涤5遍。
9) 用100ul悬浮磁珠，并加入20U的RNase-free DNase I；于37℃孵育15min;
10) 加入900ul的裂解液，吹打混匀后置于磁力架上静置3min，然后去上清；
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11) 用80ul的裂解液重悬磁珠；
3.蛋白消化与 RNA 提取
1) Input组补充裂解液至80ul加入8 μL Proteinase K，IP 组加入8 μLProteinase K；
55℃消化 15 min；
2) 向消化后的溶液加入 1 mL Trizol，用力摇匀 15 s 后，加入200 μL 氯仿，再次用力摇匀15 s 后，冰上放置 2 min；
3) 4℃、12000 g 离心 15 min；
4) 转移上清至新的 2 mL 无酶管中，加入等体积的异丙醇及6ug糖原，-80℃过夜沉淀；
5) 4℃、12000 g 离心 10 min；
6) 弃上清，加入 1 mL 75%乙醇（无酶水配制），洗涤沉淀一次；
7) 4℃、8000 g 离心5 min；
8) 小心弃上清，室温晾干 10 min，将乙醇全部挥发；加入 20 μL ddH2O（RNase DNase free），溶解 RNA，-80℃保存备用。
4. RNA反转录
1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
试剂组分使用量终浓度5×PrimeScript Buffer（for Real Time）2uL1×PrimeScript RT Enzyme Mix I0.5uLRandom 6 mers（100 μM）*10.5uL50 pmolRNA7 uL
2）按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！
3）定量PCR检测
将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心；冰上配制下表中的反应液
成分加入量终浓度Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox)5μL1×Forward Primer (10μM)0.2μL0.2 μMReverse Primer (10μM)0.2μL0.2 μMcDNA（diluted 1:5）2μLRNase-free Waterto 10μL
4）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
5）采用三步法程序进行反应：
循环数步骤温度时间荧光采集1预变性95℃5minNo40变性95℃10sNo退火60℃30sYes上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析
四、技术优势
✅ 高分辨率：紫外线交联锁定瞬时互作，单碱基精度定位结合位点
✅ 全基因组覆盖：CLIP-Seq揭示全转录组范围内的RBP靶标
✅ 动态解析：捕获环境或病理状态下的互作动态变化
✅ 多技术兼容：适配iCLIP、HITS-CLIP等多种变体，满足不同研究需求
五、适用范围
1️⃣ 基础研究：RNA结合蛋白（如Ago2、TDP-43）的靶标鉴定与功能解析
2️⃣ 疾病机制：神经退行性疾病（ALS、AD）、癌症中异常RNA-蛋白互作研究
3️⃣ 非编码RNA：lncRNA、circRNA与RBP的互作机制探索
4️⃣ 病毒学：宿主RBP与病毒RNA的相互作用分析；
5️⃣ 药物开发：靶向RNA-蛋白互作的小分子筛选与验证。
六、代表性实验结果
