欧博allbet肺炎克雷伯菌MLST分型详细操作
提起肺克其实是伤心的，欧博allbet姐被迫不做肺克已经好长时间了，突然看到我丁香园上很久以前写的帖子竟然成为优质帖，心情大好，看了下留言大部分都是好长时间以前的，想来回复他们已经没有用了。但是既然原来的附件不能下载了，我把之前的再完善翔实一下，有需要的拿去，最好能投个票留个言啥的表示感谢，祝伸手党毕不了业，哈哈哈。
1.引物：肺炎克雷伯菌的MLST的引物信息及测序结果比对等已移至该网站https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html（经常换网站），拉到最下面Primers used for MLST of Klebsiella pneumoniae。里面有两个protocol，选一个就可以啦，以下是我当时做实验用的七个管家基因的推荐引物序列：
gapA F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTATGAAATATGACTCCACTCACGG
R:TTGTGAGCGGATAACAATTTCCTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT 450bp
infB F: GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTCGCTGCTGGACTATATTCG
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCTTTCAGCTCAAGAACTTC 318bp
mdh F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG 477bp
pgi F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT 432bp
phoE F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCTGATCAGAACTGGTAGGTGAT 420bp
rpoB F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGGCGAAATGGCWGAGAACCA
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCGAGTCTTCGAAGTTGTAACC 501bp
tonB F:GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTTTATACCTCGGTACATCAGGTT
R: TTGTGAGCGGATAACAATTTCATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG 414bp
2.反应体系：
我一般配置30ul体系
水 20.52ul
10*Buffer 3ul
dNTP(2mmol/L) 1.5ul
Mg（10mmol/L）2.4ul
3'引物（20ummol/L） 0.6ul
5'引物（20ummol/L） 0.6ul
Taq酶 0.18ul
模板 1.2ul
3.扩增条件：94℃ 5min(94℃ 50s,50℃ 30s,72℃ 50s)30cycles,72℃ 10min （这个扩增条件大多数都能扩增出来的，少数有几个扩不出来的试试其它方法，比如适当调整退火温度，换用另外一个protocol 的引物，还有一个屡试不爽的方法，就是重新提取DNA，一次不行再来一次，一个方法不行换一个方法）
4.外送测序（先测一端，能比对上就OK了，比不上的话可以再把另外一端也测了，然后两段拼接一下，再重新比对），还有一点要说明一下，有些小朋友搞了半天说自己的序列比对不到任何一个等位基因，兴高采烈地以为自己发现了新的等位基因，先用冷水洗把脸，用primer premier软件打开来看一下，你测序的峰图是啥个德行，如果是乱七八糟的重叠峰之类一大堆的，你重新P，重新测，如果峰图漂漂亮亮的，那恭喜你，可能是新类型，把另外一端也测了吧，一起提交给巴氏德的那个网站注册新等位基因类型（这个菌株有新等位基因，那这株菌的ST型肯定也是新的，这个不用我说了吧）。
5.将测序结果提交至https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html网站进行比对，获得等位基因的类型，再根据七个等位基因的类型比对出该菌株的ST型。
6.比对步骤么，简单来说，点击页面上的Sequences and profiles database，进去之后点sequence query，把你测序得到的序列粘贴进去，submit就可以了，把每个基因比对出来的号码记下啦。7个基因都比对好之后，点击这个Search Klebsiella locus/sequence definitions database by combinations of loci，进去之后下拉选线选成MLST，然后把对应的数字输进去，submit，就得到ST型啦。如果比对出来没有完全对应的，那么你碰到新类型啦，同样的注册下新类型吧。
7.数据多的可以用eBURST软件啥的分析一下啦