欧博ABG官网-欧博官方网址-会员登入

   液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）是指在细胞内某些生物大分子（如蛋白质和RNA）通过相互作用，形成具有不同组分和性质的相分离液滴[1]。这些液滴类似于油滴在水中的分离状态，形成了细胞内的一种独特的亚结构。液-液相分离现象广泛存在于细胞核、细胞质和细胞器中，是许多细胞过程的重要组成部分。

一、液液相分离的生物学功能1. 形成无膜细胞器LLPS是形成无膜细胞器（membraneless organelles）的一种基本机制。这些无膜细胞器包括核仁、压力颗粒、Cajal小体、P-bodies等。它们没有由脂双层膜包围，但能够通过LLPS的机制将特定的蛋白质和核酸分子集中在一起。2. 动态调控和快速响应LLPS允许细胞快速、可逆地调控蛋白质和RNA的聚集与分散，这是细胞应对环境变化和信号传导的关键机制[2]。3. 基因表达调控LLPS对基因表达的调控具有重要作用。在RNA加工过程中，某些LLPS形成的无膜细胞器富含与RNA加工相关的蛋白质和因子，可以集中RNA编辑、剪接、降解等过程中的关键分子。在翻译过程中，通过形成翻译抑制或激活的微区，LLPS能够在翻译水平上调节特定mRNA的表达。4. 代谢调控细胞代谢中的某些反应需要通过LLPS机制来组织和优化。5. 疾病发生LLPS的异常往往与疾病相关，特别是在蛋白质聚集相关的疾病中，如神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）和某些类型的癌症。

二、相分离在肿瘤中的研究
1、相分离调控基因表达研究人员发现在m6A阅读蛋白中，细胞核内m6A阅读蛋白YTHDC1对AML细胞生存尤为关键[3]。YTHDC1在多个不同亚型的AML病例样本中显著高表达，通过敲低YTHDC1发现AML细胞增殖减慢，髓系分化增强，细胞凋亡增多并且显著抑制小鼠中AML的发展。该研究揭示了YTHDC1结合m6A-mRNA通过相分离的方式形成核内凝聚物，保护其靶点基因不被降解，促进基因表达的机制。
1）在AML细胞系中通过shRNA敲低/CRISPR敲除YTHDC1则导致AML细胞增殖减慢，髓系分化增强，细胞凋亡增多。

2）通过CRISPR/Cas9基因敲入为内源性YTHDC1加上EGFP标签，证明YTHDC1蛋白在体内和体外均进行液-液相分离。

3）通过点突变或片段敲除表征YTHDC1中IDR结构域对细胞中LLPS至关重要。

2、相分离参与DNA损伤与修复
研究人员揭示了RAP80介导的BRCA1招募的新机制[4]，为相分离在DNA双链断裂修复中的作用提供了新的见解。RAP80与Lys63连接的多聚泛素链的结合增加了多价相互作用，从而诱导RAP80在DNA损伤位点的液液相分离（LLPS）。同时发现，RAP80 LLPS增强了肿瘤细胞的放疗抵抗性，表明RAP80可能是肿瘤放疗增敏的潜在靶点。
该研究通过CRISPR敲除RAP80证明其在细胞核中形成液态冷凝物,消除RAP80的凝集显著抑制了BRCA1焦点的形成，揭示了RAP80凝集在BRCA1招募和辐射敏感性中的关键作用。

3、相分离调控肿瘤发生研究发现环状RNA circVAMP3通过促进CAPRIN1蛋白相分离[5]，在细胞内形成应激颗粒（stress granules）以阻止c-Myc mRNA的翻译，进而抑制肝细胞性肝癌（HCC）的发生发展。
1）通过基因编辑在细胞和小鼠中敲低circVAMP3，证明其具有抑制HCC细胞增殖和迁移的作用。

2）研究发现circVAMP3招募CAPRIN1-G3BP1复合物，导致蛋白聚集并发生相分离，在细胞中促进应激颗粒的形成；敲低circVAMP3，应激颗粒减少。

4、相分离与肿瘤免疫研究发现在IFNγ刺激下，肿瘤细胞中KAT8-IRF1通过形成具有促进转录功能的凝聚体，增强PD-L1表达的分子机制[6]；发现了凝聚体形成可增强KAT8对IRF1乙酰化催化速率；开发了抑制凝聚体形成的阻断多肽，并证明其抗肿瘤活性。
1）研究人员利用全基因组CRISPR-Cas9文库进行筛选，发现乙酰转移酶KAT8可调控PD-L1的表达，并通过基因敲除在细胞中得到验证。

2）通过TurboID邻近标记联合质谱分析，研究人员鉴定到转录因子IRF1与KAT8存在相互作用。

3）在KAT8 N端插入mEGFP，IRF1C端插入mCherry标签，检测二者定位，发现二者共表达在细胞核内可形成液滴状凝聚体。

4）利用dCas9-SunTag-sgARRAY进行基因组定位，研究人员观察到内源KAT8-IRF1凝聚体可定位于PD-L1启动子。

三、基因编辑技术在相分离研究中的重要性
在体外细胞水平的基因编辑（敲除/敲入）已经成为相分离研究中的常规技术手段。针对相分离的生物学研究以及在肿瘤方面的研究，起到了关键作用。随着相分离研究的进一步深入，也会催生着基因编辑技术在该领域的进一步的深度整合。
粒曼生物作为一家专注于高通量基因编辑工具研发的技术驱动型公司，将持续关注该领域，并推出相关的产品与服务，全面助力科研工作者在相分离研究！

参考文献
[1] Razin, S., Gavrilov, A.The Role of Liquid–Liquid Phase Separation in the Compartmentalization of Cell Nucleus and Spatial Genome Organization. Biochemistry Moscow 85, 643–650 (2020).
[2] Alberti S, Gladfelter A,et al.Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates.Cell. 2019 Jan 24;176(3):419-434.
[3] Cheng Y, Xie W, et al.N6-Methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation. Cancer Cell. 2021 Jul 12;39(7):958-972.e8.
[4] Qin C, Wang YL, et al.RAP80 phase separation at DNA double-strand break promotes BRCA1 recruitment. Nucleic Acids Res. 2023 Oct 13;51(18):9733-9747.
[5] Chen S, Cao X, et al.circVAMP3 Drives CAPRIN1 Phase Separation and Inhibits Hepatocellular Carcinoma by Suppressing c-Myc Translation. Adv Sci (Weinh). 2022 Mar;9(8):e2103817.
[6] Wu Y, Zhou L, et al.Disrupting the phase separation of KAT8-IRF1 diminishes PD-L1 expression and promotes antitumor immunity. Nat Cancer. 2023 Mar;4(3):382-400.